用PCR技术检测犬的结核病
作者:宠星球 狗民网 |2007-04-06

 

 

   结核分枝杆菌可引起犬肺、胃肠道或传播性疾病。由于与患结核病的人或牲畜接触较多,犬可能传播结核病。传播途径主要是呼吸道、消化道或接触传染。犬对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌一样敏感,但在农村大部分犬被结核分枝杆菌感染或由于带菌患者接触而引发此病。犬最常见的感染部位是支气管淋巴结和肺。

 

    虽然对患病的犬用适量异烟肼和链霉素进行治疗,但还没有药物治疗有效的报道。被感染的犬通常有开放的病灶,有感染的分枝杆菌通过唾沫、尿液或粪便排出体外、并对人构成威胁。该病犬在早期和中期通常无症状,甚至活动性和有开放性病灶的犬也能长期无症状。因此,对病犬早期诊断很困难。犬的肉眼病灶易混淆,类似于肉瘤病灶而不是典型的结核结节。鉴别诊断应包括真菌性肺炎和寄生虫性肺炎。组织病理学检查和培养分离此菌,对诊断起决定作用,但培养和鉴定本菌时间太长。

 

 

    本实验用DNA扩增的方法检测,从治体或剖检犬收集的组织样品中结核分枝杆菌复合症的病原。将PCR检测的结果与组织病理学和传统培养法进行对照。

 

 

 

    材料和方法

 

 

 

    收集4只怀疑结核病的犬,主要临床症状为食欲减退、呕吐、体重减轻,间歇热、嗜唾、呼吸困难、淋巴结肿大。两位主人有结核病史。对病犬做了尸体剖检和治体组织检查,对所采取的样品进行了组织病理学、细菌培养、槐黄染色和PRC检测。

 

 

 

    组织病理学检查:将样品用100%的福尔马林缓冲缓液固定,石蜡包埋,制成4am厚的切片,然后用苏木精和曙红染色。

 

 

 

    细菌学检查:将组织样品等分,1份贮存于零下80摄氏度条件下,以备重复试验。另一份取5g带病灶的样品切成小块,加无菌蒸馏水用匀浆机(IUC)处置15分钟使之匀质。然后取2ml匀浆用Tacquet和Tison(1991)的方法去污,并取10ml匀浆加入加入10m10.75%氯化脱环已基吡啶(hexadecylpyridinium chlorid)进行去污,将混合物在Sigma3—10 离心机心1068转速离心30分钟,沉淀,接种于Coletsos 和无甘油的Lowenstin 两种培养基,每周观察其生长情况,对疑似分枝菌菌落用萋一纳氏技术检查嗜酸菌,对分离菌按其形态特征及生化特性来鉴定,还用Accuprobve 探针(基因探针检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)。

 

 

 

    涂片检查;参考(1976)的方法将培养物用槐黄酚盐粉色制成涂片,用400倍荧光显微镜检查此片。

 

 

 

    DNA提取:用 litbana 等(1995)描述的方法列解细菌提取DNA,即将去污的样品加热灭活、离心,沉淀用100al蛋白酶K(0.1mg/ml)液重于56摄氏度1小时,再煮沸5分钟,用20000离心机离心5分钟,将上清液用 纯化系统处理,提取DNA。

 

 

 

    DNA扩增:用两对寡核苷酸引物进行PRC扩增来检测提取的DNA样品。第一对引物IS43(5’TcA Gcc GcG Tcc AcG ccG ccA3’)和IS41(5’CCT GCC AGC GTA GGC GTC GG3’)分别与IS6100插入成份的568至588和884至865的碱基配对。第二对引物TBIF(5‘GAA CAA TCC GGA GTT GAC AA3’)和TBIR(5’AGC ACG CTG TCA AGC ATG TA3’)和TBIP(5’AGC ACG CTG TCA AGC ATG TA3’)对MPB70基因的276至295和647至628的碱基配对。两个反应用PIC—100程序控温仪在标准条件下进行,每个反应加50ngIS41、50ngIS43及20ngTBTIF、20ngTBIR寡核苷酸退火温度分别为68摄氏度、60摄氏度。扩增的DNA主段大小分别为317bp(IS110) 372bpCMpB70基因),用2%的琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭(0.5ag/ml)染色检测扩增结果。每组实验包括阳性和阴性对照。

 

 

 

    用Mutu—GeneR体外诱变试剂盒(BIO—RNA )来定点诱变寡核苷酸构建重组质粒。对照质粒PPG10,含有IS41和IS43反义链寡核苷酸序列,且被1250碱基分隔,这一质粒通常被用作IS6110PCR扩增时对照。

 

 

 

    Southem印迹杂交;通常用于检测PCR产物的特异性。电泳之后,被扩增的DNA通过Southem印迹被转移到带正电荷尼龙薄膜上,这一过程用785真空印迹装置(BIORAD)可变真空泵在40mbar于0.4N氢氧化钠溶液中进行。将薄膜在2xssc中浸泡(0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠),经空气干燥,以120摄氏度20—30分钟加热固定DNA。

 

 

 

    通过PCR技术扩增分枝杆菌IS6110和MPB70双链DNA,并用地高辛配体---N ----duPT标记制成探针。寡核苷酸IMS1(5’GCT GAG GGC ATG GAG GTG GC3’) INS2(5’GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA3’)及TBIF和TBIR分别用于纯牛分枝杆菌染色体AH5DNA 245bp和372bp片段的扩增。该反应在地高辛配体—11—duPT加入DNTPS混合比例为1:3的条件下进行。PCR产物用Nugic Miniprips(Promega)纯化。

 

 

 

    将薄膜用5乘以SSC,0.1%的N一十二烷基肌氨酸,0.02% 的十二烷基磺酸钠及0.1%的阴断抑制剂在42摄氏度下温育过液。杂交后的薄膜 在室温下用2XSSC,0.1%十二烷基磺酸钠洗耳恭听涤2次,每次5分钟,之后用0.5乘以SSC,0.1%的十二烷基磺酸钠在42摄氏度洗涤2次,每次15分钟。

 

 

 

    此高辛配体检测法:现在制造厂推荐用碱性磷性磷酸酶标记抗体DNA检测试剂盒以及氨蓝四唑和X—磷酸酶比色检测地高辛配体标记探针记探针的存在,产生影像影印到乙酸幻灯片上(3M)并被拍摄下来。

 

 

 

    结果

 

 

 

    1一只犬(1号)患有粟粒状的结核,胸、腹部器官广泛弥散性结节,有严重的干酪样变和钙化,皮肤可见痿孔损害。

 

 

 

    2眼观及组织病理学检查,可见犬的结核病变。

 

 

 

    3从怀疑患结核病的一只犬(1号)培养分离到结核分枝杆菌。

 

 

 

    4用根对IS6110插入片段和MPB70基因的引物作PCR已证实细菌培养为阳性的犬(1号)患结核分枝杆菌复合症。另外3只犬的样口细菌培养为阴性,PCR检测结果也为阴性。阴性对照排除了样品DNA被污染的可能,内部对照质粒也未出现假阴性结果。

 

 

 

    细菌培养,涂片检查及用PCR对病犬检测结果表明,用琼脂糖凝胶电泳,经溴化已锭染色检测临床样品PCR扩增的DNA。IS6110和MPBA70探针及Southem印迹分要,证实了从1号狗提取的DNA经PCR扩增产物的特异性。

 

 

 

    由于结核病在发病和潜伏上的特点,对人类已构成了威胁。但犬的结核病没有引起人们的足够重视。引外,犬的结核病又作为人的结核的指示,因为犬病可能是由人传染的。如1号犬在表现出任何临床症状之前,其主人被确诊为结核病。同时也证明PCR是检测犬结核的准确而有效的办法。

 

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